人喉表皮样癌HEp-2细胞、宫颈癌HeLa细胞和人胚胎肾上皮样HEK293细胞购自中国科学院细胞库（上海）；青链霉素（货号：15140122）、胰蛋白酶-EDTA（货号：15400054）、Lipofectamine 3000（货号：L3000015）购自美国Thermo Fisher公司；Cell counting kit-8 （CCK-8）（货号：c0005）购自美国TargetMol公司；异麦角甾苷（货号：HY-N0022）购自上海MedChemExpress （MCE）中国公司；TRIzol试剂（货号：15596018CN）购自美国Invitrogen公司；逆转录酶（货号：RK20433）购自武汉ABclonal公司；本文所用引物均订购于南京擎科生物。承蒙武汉大学陈明周博士惠赠质粒N-Myc和GFP-P；安徽医科大学黄升海博士惠赠RSV-A，广州实验室张琼博士惠赠RSV-A-GFP。激光扫描共聚焦显微镜（型号：LSM800）购自德国蔡司公司；酶标仪（型号：Spark）购自瑞士帝肯公司。

HEp-2细胞、HeLa细胞和HEK293细胞培养在含10% FBS和100 μg/mL的青链霉素的DMEM培养基中，细胞培养箱温度设定为37 ℃，CO₂含量设定为5%。

将RSV感染的HEp-2细胞分为对照组和10 μmol/L异麦角甾苷处理组，每组设置3个重复。生长在24孔板中的HEp-2细胞达到90%丰度时，按感染复数为0.5进行RSV感染，然后加入异麦角甾苷。感染72 h后，收集细胞，分析异麦角甾苷对RSV复制的抑制作用。

将质粒用Lipofectamine 3000将GFP-P和Myc-N进行共转染，6 h后加入或不加入10 μmol/L异麦角甾苷，24 h后用4%的多聚甲醛固定细胞，然后用0.1%的Triton X-100打孔，在封片前用DAPI标记细胞核，然后在激光扫描共聚焦显微镜（LSM800）下成像^［8］，确定异麦角甾苷对包涵体形成的影响。

使用TRIzol试剂分别从模拟感染或RSV感染的细胞中提取总RNA，操作步骤遵循生产厂家说明书。每个样本取1 mg总RNA，采用逆转录酶进行逆转录反应，随后通过qPCR分析检测特定RNA的表达量。所示数据均为经GAPDH标准化后的目标RNA相对表达量。所用引物序列如下：人GAPDH正向引物：5′-AATCCCATCACCATCTTCCAG-3′；人GAPDH反向引物：5′-AAATGAGCCCCAGCCTTC-3′；小鼠GAPDH正向引物：5′-GATTTGACC TTAGTACAAGGAGATAA-3′；小鼠GAPDH反向引物：5′-AGA CAAGTAGACCAATGGAATAGAA-3′；RSV F正向引物：5′-AGGTGTTGGATCTGCAATCG-3′；RSV F反向引物：5′-TTTGTTCACTTCCCCTT CTAGG-3′；RSV M正向引物：5′-TTCACGAAG GCTCCACATAC-3′；RSV M反向引物：5′-TGATTG GAACATGGGCACC-3′；IL-4正向引物：5′-TTTGGC ACATCCATCTCCG-3′；IL-4反向引物：5′-CTGCTC TTCTTTCTC-3′；IL-6正向引物：5′-CACCAGCAT CAGTCCCAAGAAG-3′；IL-6反向引物：5′-TGGAG CCCACCAAGAACGA-3′。

在96孔板中接种HEp-2细胞 （密度为6×10⁴细胞/mL），培养过夜。第2天分别加入0.1、0.5、1、2、4、8、16、32、64、128、256 μmol/L异麦角甾苷，每个浓度处理的细胞设置3个重复，培养48 h后，除去培养基，加入100 μl CCK-8工作液，将96孔板放回培养箱内培养1 h，然后用酶标仪测定450 nm处光吸收值，将处理后的数据导入GraphPad Prism 8.0，选择非线性回归中的分析模块进行曲线拟合，从结果中可以得到IC₅₀值。

用RSV-A-GFP病毒（MOI=0.2）感染HEp-2细胞，2 h后将培养基换为新鲜的含有10% FBS的DMEM，然后分别加入0.01、0.1、0.5、1、5、10 μmol/L异麦角甾苷，每个浓度处理组细胞设置3个重复，48 h后，测定每孔细胞GFP荧光强度，然后将数据导入GraphPad Prism 8.0，选择非线性回归中的分析模块进行曲线拟合得到EC₅₀值。

先将HEp-2细胞接种于24孔板中，在37 ℃、5% CO₂条件下培养过夜至细胞密度达70%~80%，加入或不加入10 μmol/L异麦角甾苷进行处理。将RSV病毒原液用DMEM培养基进行10倍梯度稀释，最高稀释度至10⁵。取400 μL稀释液加入细胞培养孔，在37 ℃、5% CO₂条件下作用2 d。随后更换为甲基纤维素覆盖层，继续在37 ℃、5% CO₂条件下培养3~4 d。最后通过结晶紫染色并计算病毒滴度。

将18只7周龄BALB/c雌鼠适应性饲养3~5 d后，分为正常对照组，RSV病毒感染组以及异麦角甾苷治疗组，每组6只小鼠。RSV病毒感染组和异麦角甾苷治疗组每只小鼠滴鼻感染RSV 1×10⁶ PFU，治疗组小鼠通过灌胃给药，异麦角甾苷使用剂量为25 mg/kg，连续给药5 d，2次/d，两次给药间隔10 h。5 d后小鼠被麻醉，处死后取出肺组织，用于测量RSV病毒载量，或制成切片进行苏木精-伊红染色，然后在显微镜下拍照并进行图像分析。

采用GraphPad Prism 8.0进行数据统计分析。所有实验数据以x¯±s表示。两组间差异采用t检验分析，多组间差异采用单因素方差分析（ANOVA），两两比较采用LSD-t检验，P<0.05为差异有统计学意义。

CCK-8法检测结果显示，在测试浓度范围内，异麦角甾苷表现出较低的细胞毒性。利用表达绿色荧光蛋白的重组RSV毒株，通过监测不同浓度药物处理下细胞中荧光强度的变化，测定异麦角甾苷对病毒复制的抑制效率。根据剂量效应曲线计算，异麦角甾苷的IC₅₀为120.7 μmol/L，而其抑制RSV复制的EC₅₀仅为256.2 nmol/L。这一结果表明，异麦角甾苷对宿主细胞的毒性极低，且具有高效抗病毒活性。见图1。

qPCR分析结果显示，与对照组相比，经异麦角甾苷处理的RSV感染HEp-2细胞中，RSV F（t=17.13， P<0.001）和M基因（t=18.22， P<0.001）的mRNA水平均呈现下降。空斑实验检测结果显示，异麦角甾苷处理组细胞培养上清中的感染性病毒粒子数量低于对照组（t=15.32， P<0.001）。这组数据共同证实了异麦角甾苷在体外能够有效抑制RSV的复制。见图2。

荧光显微镜图像表明，在对照组细胞中，GFP-P蛋白与Myc-N蛋白组装形成大量绿色荧光斑点结构，此即为典型的类包涵体结构。然而，在异麦角甾苷处理组中，此类荧光斑点结构的数量显著减少。通过对细胞中绿色荧光点状结构进行定量统计，结果表明，与对照组相比，10 μmol/L 的异麦角甾苷能够减少由N、P蛋白共表达所诱导形成的包涵体数量（t=16.12， P<0.001）。见图3。

肺组织病理学分析显示，与未感染对照组相比，病毒感染对照组小鼠肺部呈现出典型的炎症病理变化，表现为炎性细胞浸润及肺泡间隔增厚；然而，异麦角甾苷治疗组小鼠的肺组织病理损伤得到显著缓解，其炎症程度明显减轻。qPCR检测结果显示，治疗组小鼠肺组织中RSV F（t=19.52， P<0.001）与 M基因（t=18.76， P<0.001） 的mRNA水平相较于病毒感染对照组降低，这表明异麦角甾苷在体内同样能有效抑制病毒复制。此外，病毒感染引发了强烈的炎症反应，导致关键炎性因子IL-4、IL-6 mRNA水平升高；而经异麦角甾苷治疗后，IL-4 （t=14.76，P<0.01）与 IL-6（t=21.13，P<0.001）的表达下降。以上数据表明，异麦角甾苷在RSV感染的小鼠模型中能够有效抑制病毒复制、减轻肺部炎症病理损伤。见图4。