肉豆蔻提取物（货号：W530427）购自美国Sigma-Aldrich公司；RAW264.7小鼠单核巨噬细胞白血病细胞（货号：TCM-C766）购自上海海星生物技术有限公司。Active + Pro Caspase-3重组兔单克隆抗体（货号：ET1608-64）购自杭州华安生物技术有限公司；p-MAPK3、MAPK3、p-AKT1、AKT1抗体（货号：9101S、4696、75692、13461）购自美国Cell Signaling Technology公司；p-JUN、JUN抗体（货号：HY-P80456、HY-P80084）购自上海MCE公司；热休克蛋白90（heat shock protein 90，HSP90）小鼠单克隆抗体（货号：TA500494）购自美国OriGene Technologies公司。HRP标记的山羊抗小鼠IgG（H+L）和山羊抗兔IgG（H+L）二抗（货号：SA00001-1、SA00001-2）购自武汉Proteintech公司；细胞凋亡检测试剂盒（货号：40302ES20）购自上海翌圣生物科技有限公司；YO-PRO-1/碘化丙啶（YO-PRO-1/propidium iodide，YO-PRO-1/PI）染色试剂盒（货号：C1075S）和末端脱氧核苷酸转移酶介导的 dUTP 缺口末端标记法（terminal deoxynucleotidyl transferase-mediated dUTP nick-end labeling， TUNEL）染色试剂盒（货号：C1090）均购自上海碧云天生物技术有限公司。

细胞培养箱（型号：3111）、低温离心机（型号：Legend Micro 17R）购自美国Thermo Fisher Scientific公司；超净工作台（型号：HFsafe-900）购自香港Heal Force公司；蛋白免疫印迹电泳仪（型号：1645050）购自美国Bio-Rad公司；凝胶成像系统（型号：Amersham Imager 600）购自上海思拓凡公司；酶标仪（型号：EnVision）购自美国PerkinElmer公司；流式细胞仪（型号：CytoFLEX）购自上海贝克曼库尔特公司；正置荧光显微镜（型号：Ni-U）购自日本Nikon公司。

为筛选肉豆蔻的活性成分及其作用靶点，本研究采用多数据库联合筛选策略。首先，通过TCMSP数据库（https：//old.tcms-pe.com/tcmsp.php），根据口服生物利用度（oral bioavailability，OB）≥30%和类药性（drug-likeness，DL）≥0.18标准，筛选出具有较好吸收性和成药性的活性成分及其潜在靶点。随后，利用Uniprot数据库（https：//www.uniprot.org/）对靶点蛋白进行查询，获取并标准化人类基因名称。进一步通过SwissTargetPrediction（http：//www.swisstargetprediction.ch/）和PharmMapper（http：//www.lilab-ecust.cn/pharmmapper/）数据库挖掘更多潜在靶点。最终，整合上述数据库结果，去除重复项，获得肉豆蔻有效成分作用靶点，用于后续的研究。

本研究通过DrugBank（https：//go.drugbank.com/）、OMIM（https：//omim.org/）、GAD（https：//geneticassociationdb.nih.gov/）和DisGeNET（http：//www.disgenet.org/）数据库，以“AS”为关键词检索相关靶点。整合不同数据库结果并去除重复项后，最终获得了AS的潜在靶点。随后，使用R语言对肉豆蔻靶点与AS靶点进行交集分析，并通过运行venny.R脚本绘制韦恩图，从而获得二者的共同作用靶点。

通过R语言中“clusterProfile”包对肉豆蔻和AS共有靶点进行基因本体论（gene ontology，GO）富集分析和京都基因与基因组百科全书（Kyoto encyclopedia of genes and genomes，KEGG）富集分析，并以校正后P≤0.01作为显著性阈值筛选标准。富集结果通过R语言中“dotplot”函数进行可视化，展示主要的生物过程和信号通路。

使用STRING平台（https：//www.string.db.org/）对共同靶点进行PPI网络分析，选择“Multiple Proteins”模式，物种设置为“Homo sapiens”，并采用默认参数导出TSV格式文件。随后，导入Cytoscape进行可视化。通过 Network Analysis 插件进行拓扑筛选，以自由度、接近中心性及介度中心性均≥中位数为标准，共获得107个核心靶点，并将前10个关键节点以红色高亮显示。

通过NCBI网站（https：//www.ncbi.nlm.nih.gov）中GEO数据库获取GSE28829和GSE120521数据集，其中GSE28829数据集中包含29个AS斑块样本（其中早期斑块15个，晚期斑块14个）的基因表达谱数据，而GSE120521数据集中包含8个样本（4对稳定和不稳定斑块区域样本）的RNA测序数据。

通过DESeq2包对基因表达数据进行标准化处理，并鉴定差异表达基因。校正后的P值（P_adjust）<0.05时，该基因被视为差异表达基因。GSEA分析使用GSEA软件4.1.0进行，参考基因集c5.bp.v7.0.symbols.gmt从官方GSEA下载。基因集的显著性阈值设为校正后的P<0.05。

精密称取肉豆蔻提取物粉末，将其溶解于无菌的生理盐水中，充分混匀后制成1 mg/mL的母液，并分装保存于4 ℃冰箱中备用。

将RAW264.7细胞置于37 ℃、5% CO₂、饱和湿度的培养箱中，在含10%胎牛血清的高糖DMEM培养基中进行培养。当细胞生长至80%~90%汇合度时，使用细胞刮刀刮取使其脱落，随后进行传代或接种铺板。

采用CCK-8试剂检测处理后细胞的吸光度（absorbance， A）值，以评估RAW264.7细胞活力。参考预实验和文献报道^［2］的活性范围设定，实验共分为7组，包括对照组及6组给药组。给药组中肉豆蔻浓度分别为1、10、20、50、100和200 μmol/L。将处于对数生长期的RAW264.7细胞接种于96孔板中，贴壁后更换为含不同浓度药物的培养基，24 h后，弃去原培养基，向每孔加入含10% CCK-8试剂的新鲜培养基，于37 ℃孵育30 min，随后在450 nm波长下测定各孔的A值。

本研究设对照组、H₂O₂模型组和肉豆蔻给药组。模型组以 300 μmol/L H₂O₂处理细胞2 h建立氧化应激模型；给药组先以20 μmol/L肉豆蔻预处理24 h，再加入300 μmol/L H₂O₂处理2 h；对照组则在无药物的完全培养基中培养。

将对数生长期的RAW264.7细胞接种于6孔板并完成药物处理后，用RIPA裂解液提取总蛋白，BCA法测定蛋白浓度。随后进行SDS-PAGE电泳并将蛋白转膜至PVDF膜。室温封闭1 h后加入一抗，4 ℃孵育过夜。TBST洗膜3次后加入二抗，于室温孵育1 h，再次洗膜3次。最终以化学发光法显影，并使用 ImageJ分析灰度值，以HSP90为内参计算目标蛋白的相对表达量。

按上述方式处理细胞后，收集上清液和细胞沉淀，用100 μL 1× Binding buffer重悬，加入5 μL Annexin-FITC和2 μL PI，在避光条件下孵育15 min。随后加入400 μL Binding Buffer 混匀，用流式细胞仪检测。Annexin V⁺FITC/PI^-为早期凋亡，Annexin V⁺FITC/PI⁺为晚期凋亡，凋亡率为早期与晚期凋亡细胞比例之和。

将RAW264.7细胞接种于24孔板中，每孔约10万个细胞，细胞贴壁后进行药物干预。用4% PFA室温固定30 min，PBS洗3次，加入染色工作液100~200 μL，室温孵育30 min。PBS洗3次，每次5 min，控干水分后使用封片剂封片。荧光显微镜下观察并拍摄照片，使用ImageJ软件统计阳性细胞数量。

与1.3.7实验条件一致，将处理好的细胞用4% PFA室温固定30 min，PBS洗3次。用0.1% Triton X-100室温通透8 min后PBS洗2次。随后与含有末端转移酶和标记核苷酸的TUNEL反应液在37 ℃避光孵育60 min，用DAPI进行细胞核复染后封片观察，通过ImageJ软件统计阳性细胞数量。

为获得肉豆蔻的活性成分及其潜在靶点，首先通过TCMSP数据库检索其主要活性成分，并以OB≥30%和DL≥0.18作为筛选标准，筛选出9个具有较好的口服吸收效果和较高成药性的有效活性成分（表1）。随后，利用TCMSP、SwissTargetPrediction和PharmMapper数据库检索这些活性成分的潜在作用靶点。在这3个数据库中分别检索到59、372和651个作用靶点。综合3个数据库结果后，每个成分平均有342个潜在作用靶点，删除重复靶点后得到941个肉豆蔻活性成分的作用靶点。

为系统性获取AS相关的靶基因，利用DrugBank、GAD、OMIM和DisGeNET数据库对AS的靶基因进行检索，获得靶基因数量分别为46、354、3和2 044个。经去重后，共得到2 184个与AS相关的靶基因。随后，对肉豆蔻活性成分与AS靶基因进行交集分析，获得293个共同靶点（图1）。进一步分析肉豆蔻的9个主要活性成分作用于293个共同靶基因的数量，发现除Compound 8作用于其中的13.7%（40/293）个靶基因外，其余成分平均作用于57.0 %（167/293）的共同靶基因。见表2。

为阐明肉豆蔻作用AS的潜在机制，本研究对肉豆蔻和AS的共同靶基因进行了GO和KEGG富集分析，以校正后的P<0.01且Count>10为显著标准。结果显示， 293个靶基因主要富集在762个GO生物学过程和122个KEGG信号通路，其中显著性前10的GO和KEGG通路见图2。GO富集主要集中于脂多糖应答、氧化应激、炎症调控及脂肪酸代谢（图2A）。KEGG通路富集结果中，显著性前10的KEGG通路中主要涉及脂质和动脉粥样硬化、Rap1信号通路及细胞凋亡等关键通路（图2B）。

为鉴别肉豆蔻作用AS的关键靶基因，通过STRING数据库构建PPI共表达网络。将293个共同靶点基因导入STRING并经Cytoscape可视化，获得包含293个节点和3 903条相互作用边的网络。利用Network Analyzer按自由度、接近中心性、介度中心性大于或等于中位数为筛选条件，获得107个核心靶基因（图 3A）。其中连接度≥66的关键节点包括ALB（98）、AKT1（95）、CASP3（75）、SRC（75）、JUN（74）、MAPK3（74）、EGFR（72）、PPARG（71）、MMP9（69）、HIF1A（66）及PTGS2（66）（图3B）。通过对上述关键靶基因的生物学功能注释分析提示，其中JUN、CASP3、MAPK3和AKT1基因参与细胞凋亡相关信号通路。

为明确肉豆蔻中主要活性成分与参与细胞凋亡相关关键靶基因之间的结合能力，选取JUN、CASP3、MAPK3和AKT1四个参与凋亡信号通路的核心靶点进行分子对接分析。靶点蛋白三维结构分别从PDB数据库中获取，PDB ID分别为2fpd（JUN）、5i9t（CASP3）、6ges（MAPK3）、4ejn（AKT1）。结果显示，各活性成分与四个靶蛋白的最低结合能均 < -20.92 kJ/mol（表3），提示其结合构象稳定、相互作用较强，可能通过调控这些靶点参与凋亡通路。

为明确肉豆蔻核心靶点及其调控的细胞凋亡通路在AS进展中的激活情况，分析GEO数据库中AS斑块早期和晚期（GSE28829），以及稳定和不稳定斑块（GSE120521）的基因表达数据集。差异分析共鉴定出2 600个（早期vs晚期）和4 365个（稳定vs不稳定）差异基因（图4A、4D）。基于差异基因的GSEA结果显示，白细胞凋亡通路在晚期斑块（NES=2.31，P_adjust=0.000 06）和不稳定斑块（NES=2.33，P_adjust=0.000 3）中均显著富集（图4B、4E）。进一步分析显示，除AKT1在早期和晚期斑块中基因表达存在显著差异外，其余基因在不同病程阶段未呈现显著变化（图4C、4F）。

为筛选肉豆蔻提取物对RAW264.7细胞的适宜处理浓度，分别以不同剂量处理细胞24 h，并采用CCK-8法检测细胞活力。结果显示，各给药组细胞活力均保持在95%以上，与空白对照组相比，差异无统计学意义，细胞生长状态良好（图5）。结合CCK-8结果及预实验数据，最终选定20 μmol/L作为后续实验的最佳处理浓度。

为验证肉豆蔻对巨噬细胞凋亡相关蛋白表达的影响，采用Western blot检测各组JUN、CASP3、MAPK3、AKT1及其活性形式（p-JUN、Cleaved-CASP3、p-MAPK3、p-AKT1）的表达水平。与对照组比较，模型组Cleaved-CASP3（P=0.006 4）和p-MAPK3（P=0.000 3）表达水平升高，p-AKT1（P=0.002）表达水平降低；与模型组比较，肉豆蔻干预组 Cleaved-CASP3（P=0.04）和p-MAPK3（P=0.000 3）表达水平下降，p-AKT1（P=0.004）表达水平升高，各组p-JUN表达水平差异无统计学意义。见图6。

为验证肉豆蔻的抗凋亡作用，采用流式细胞术及YO-PRO-1/PI双染和TUNEL染色对 H₂O₂诱导的巨噬细胞凋亡进行评估。流式结果显示，肉豆蔻处理组的凋亡比例较模型组降低（P=0.001 2）。YO-PRO-1/PI双染结果显示，与模型组比较，肉豆蔻处理组早期凋亡细胞（YO-PRO-1⁺）（P=0.001 2）及晚期凋亡/坏死（PI⁺）（P=0.009 7）细胞比例均下降。TUNEL染色结果显示，与对照组比较，模型组TUNEL阳性细胞增加（P=0.000 3），而与模型组比较，肉豆蔻处理组TUNEL阳性细胞减少（P=0.010 5）。见图7。