南蛇藤饮片购自广州致信药业有限公司（批号：070510），参照课题组授权专利（ZL2007100253433）优化提取工艺^［4］，先对南蛇藤饮片进行预处理（特定筛目粉碎以提升提取效率），再按比例加入乙醇，控制温度与提取时长进行热回流提取；通过旋转蒸发仪回收溶剂并浓缩至特定状态，复溶后按顺序用不同极性溶剂分步萃取（控制萃取比例以分离有效成分），最终经真空冻干工艺制得COE，后续通过专属检测方法确认其主要活性成分的质量。

TRIzol 试剂（美国Solarbio公司，批号R1100）、逆转录试剂盒（北京宝日生物有限公司，批号RR036A）、RT-PCR试剂盒（美国Promega公司，批号A6001）、N-甲基-N′-硝基-N-亚硝基胍（N-methyl-N′-nitro-N-nitrosoguanidine， MNNG）（日本Kabushiki公司，货号ZG4T1-FP，纯度≥98%）、苏木精染色液（武汉塞维尔生物科技有限公司，批号 G1004）、伊红染液（上海国药集团化学试剂有限公司，批号71014544）、乳酸试剂盒（上海酶联生物科技有限公司，批号mLsh0715）；一抗HK2（美国Thermo Fisher公司，批号PA5-29326）、PKM2（美国Thermo Fisher公司，批号PA5-28700）、FOXO4（美国Thermo Fisher公司，批号PA5-32385）、LDHA（美国Cell Signaling Technology公司，批号3582S）、GLUT1（美国Santa公司，批号sc-377228），二抗山羊抗兔（美国ImmunoWay公司，批号RS0002）；引物由Primer Premier 5.0软件设计、上海生工生物工程股份有限公司合成；FOXO4 过表达质粒［载体pcDNA3.1 （+），HindIII/XhoI酶切位点，插入全长FOXO4 cDNA序列 NM_001106331.1，经Sanger测序验证］，FOXO4沉默质粒（载体pLV-shRNA慢病毒载体，含3条靶向shRNA序列：5′-GCTGGAGTATCTGCTGTCTT-3′、5′-GATGAGTACATCGTCCTGAT-3′、5′-GCTGACA GATGAGATGCTGT-3′，经Sanger测序验证）。见表1。

TS100 倒置显微镜（日本 Nikon 公司）用于胃黏膜组织形态初步观察，放大倍数设定为 ×100（观察整体结构）与 ×200（观察局部病变）；CFX96 型 Touch PCR 仪（美国 BioRad 公司）用于RT-PCR 检测，反应程序设定为：95 ℃预变性 3 min，95 ℃变性 15 s、60 ℃退火30 s、72 ℃延伸 30 s，共 40 个循环，溶解曲线分析范围 65～95 ℃（验证引物特异性）；KZ-Ⅱ 型号匀浆仪（武汉 Servicebio公司）用于胃黏膜组织匀浆，转速设定为 3 000 r/min，每次匀浆 30 s，间隔 10 s，重复 3 次。

SPF级雄性SD大鼠饲养于安徽医科大学实验动物中心，饲养环境控制为温度（23±1）℃、相对湿度（50±5）%、12 h光照/12 h黑暗，每笼3只，自由摄食无干扰成分的标准饲料及无菌饮水，每周更换垫料2次。适应性饲养1周，每日观察活动及进食情况，排除健康异常个体后，按随机数字表分为9组（n=11）：对照组、模型组、COE组、OE-NC组、OE-FOXO4组、OE-FOXO4+COE组、shNC组、shFOXO4组、shFOXO4+COE组。除对照组外，其余组均给予170 μg/mL MNNG无菌生理盐水溶液（每周更换1次）自由饮水，饲喂含0.03%盐酸雷尼替丁的标准饲料，采用“饲喂2 d-禁食1 d”循环，禁食当日下午按10 mL/kg灌胃2%水杨酸钠溶液，造模6周。造模期间每周以酚红排空法记录胃排空时间（模型组需≥60 min），确保病理进程稳定。造模结束后每组随机处死1只大鼠，取胃黏膜组织经4%多聚甲醛固定、石蜡包埋、4 μm切片及HE染色，由2名病理科医师双盲阅片，参照《胃癌前病变诊断与治疗共识》判定：出现胃黏膜肠上皮化生或中-重度异型增生且无明显癌变特征为造模成功，未达标则延长造模1周后复检。

大鼠 FOXO4 过表达质粒以 pcDNA3.1 （+） 为载体，通过 HindIII/XhoI 双酶切位点插入 FOXO4 全长 cDNA（NM_001106331.1），Sanger 测序验证序列正确性；沉默质粒选用pLV-shRNA 慢病毒载体，设计3条靶向FOXO4的 shRNA 序列（5′-GCTGGAGTATCTGCTGTCTT-3′、5′-GATGAGTACATCGTCCTGAT-3′、5′-GCTGACA GATGAGATGCTGT-3′），经 Sanger 测序验证后，通过Western blot筛选敲低效率最优序列用于后续实验，参照杨劭劼^［5］的检测条件：蛋白电泳电压 80 V（浓缩胶）、120 V（分离胶），转膜采用 90 V 恒压（按目标条带分子质量调整时间），孵育二抗时加入内参蛋白 GAPDH，确保蛋白上样量一致。构建完成后，通过 Western blot 和 RT-PCR 验证 FOXO4 过表达和沉默效率，选择过表达效果稳定、敲低效率最佳的序列进行后续实验。

GPL造模起始时，OE-FOXO4组、OE-FOXO4+COE组大鼠尾静脉注射浓缩 OE-FOXO4质粒（无菌林格氏液稀释，1 mL/100 g体质量，室温），OE-NC 组注射等量GFP过表达质粒作为阴性对照；shFOXO4组、shFOXO4+COE组注射浓缩shFOXO4质粒（同前稀释条件），shNC组注射等量乱序shRNA质粒作为阴性对照。造模第1、3、5周各注射1次，共3次。 预实验确定最优质粒浓度：大鼠注射不同浓度FOXO4过表达质粒，72 h后检测胃黏膜FOXO4 mRNA，选取升高2倍以上的最低浓度用于正式实验；正式注射时，质粒稀释至目标浓度后，于尾静脉近心端缓慢注射（≥30 s，避免外渗），注射后观察尾静脉有无红肿。转染结束后通过qPCR验证效率：过表达组mRNA升高≥2倍、沉默组降低≥50%为合格。

本实验药物剂量选择给予COE给药组COE 50 mg/kg灌胃处理，该剂量基于预实验数据筛选：设置25、50、100 mg/kg三组，干预4周后，50 mg/kg 组胃黏膜损伤评分降低42%（显著高于其他两组），且血清ALT水平（28.5±3.2） U/L与对照组（26.1±2.8 ）U/L相比，差异无统计学意义，排除肝毒性风险。COE组、OE-FOXO4+COE组、shFOXO4+COE组在造模开始2周后，给予COE 50 mg/kg灌胃，其余组给予等量0.9%的氯化钠溶液灌胃，1次/d，干预4周后处死。

给药期结束后，大鼠禁食12 h（自由饮水），经颈椎脱臼法处死。迅速完整剥离贲门至幽门的胃组织（避免黏膜损伤），置于预冷无菌DPBS（含1%青霉素-链霉素，4 ℃）中；超净工作台内剔除胃壁脂肪及结缔组织，沿胃大弯剪开，冷DPBS轻柔冲洗胃腔，无菌载玻片单向均匀刮取约0.5 mm厚胃黏膜。黏膜组织分2份：1份放入4%多聚甲醛固定液（用于病理检测），1份置于无酶EP管（加1 mL TRIzol试剂，-80 ℃冻存用于分子检测），每份样本清晰标记组别、编号及取样时间。

免疫组化染色参照EnVision二步法：组织切片脱蜡水化后，用枸橼酸盐缓冲液（pH 6.0）微波抗原修复（中火5 min、小火10 min，自然冷却），3%过氧化氢室温孵育10 min阻断内源性过氧化物酶活性；5%山羊血清37 ℃孵育30 min封闭；一抗置于湿盒4 ℃孵育过夜，PBS缓冲液（含0.05%Tween-20）轻柔冲洗3次（每次5 min）。结果用Image-Pro Plus 6.0软件判读，×200视野随机选取5个非重叠区域，测定吸光度A值，数值越大表示蛋白表达越强。

切片经 5% BSA 封闭后，加入 1∶200 稀释的一抗（4 ℃孵育过夜），洗涤后滴加 1∶400 稀释的荧光标记二抗（山羊抗兔 IgG Alexa Fluor 488/594，37 ℃避光孵育 30 min），DAPI 核染色 5 min，使用含抗荧光淬灭剂进行封片处理。在共聚焦显微镜下对应激发波长通道（488、594、358 nm）采集图像，每个样本取5个 ×400 视野，确保曝光条件一致。

取 100 mg 组织样本放入匀浆管中，加入 1 mL TRIzol 试剂后，使用匀浆仪对组织进行充分研磨。按照试剂盒的操作要求提取总 RNA，随后检测总 RNA 的纯度与浓度。接着，依据逆转录试剂盒的操作流程将 RNA 逆转录。PCR 扩增操作按试剂盒说明进行。以 GAPDH 作为内参基因，采用 2^－ΔΔCT法计算相关数据，并利用 GraphPad Prism 8.4.0 软件完成统计绘图。RT-PCR 的引物序列详见表 1。

乳酸含量检测采用乳酸脱氢酶催化法（试剂盒购自上海酶联生物科技有限公司），原理为：乳酸脱氢酶能够将乳酸与 NAD⁺进行反应，生成丙酮酸和 NADH，NADH 在 340 nm 处有特征吸收峰，A值与乳酸浓度呈正相关；操作时严格按试剂盒说明书设定反应体系（200 μL / 孔，含样本 10 μL、酶试剂 190 μL），37 ℃孵育 15 min 后用酶标仪检测 340 nm 处A值，每个样本设置 3 个平行孔，取均值代入标准曲线（用已知浓度的乳酸标准品绘制）计算乳酸含量，检测前用试剂盒自带的质控品验证检测准确性（质控品检测值在说明书参考范围内视为合格）。